人間充質干細胞成軟骨誘導試劑盒

人間充質干細胞成軟骨誘導試劑盒

僅用于科學研究

產品信息

產品名稱：人間充質干細胞成軟骨誘導試劑盒

貨號：FY200008

批號：見包裝

存儲與有效期：

組分A、E于2-8 ℃避光保存，組分B、C、D于-20 ℃避光保存。所有組分均須避免反復凍融及復溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的預混液于2-8 ℃保存，有效期1個月，完全培養基現配現用，2-8 ℃保存不超過72 小時。

適用細胞：

人骨髓間充質干細胞、人脂肪間充質干細胞、人臍帶間充質干細胞、人羊膜間充質干細胞、人牙髓間充質干細胞、人臍帶血間充質干細胞，其他組織來源的人間充質干細胞。

產品介紹

間充質干細胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞。2006年國際細胞治療協會（ISCT）確定此三項檢測指標是MSC鑒定的必檢項目，目前以MSC為基礎的研究報道均會對該三個指標進行鑒定。在多種組織來源和制作方法的MSC藥品質量控制中，成骨、成脂、成軟骨也是必檢指標。

為滿足科研和制藥對MSC分化能力的鑒定，弗元生物結合多年MSC研究經驗優化MSC誘導試劑盒，在穩定性、易用性上大幅改進，采用了獨創的小包裝。該試劑盒的設計用途，首先，用于鑒定人MSC是否具有成骨分化能力，滿足MSC質量控制的要求。其次，在再生醫學和組織工程研究中，誘導培養基也可作為除支架以外的培養培養體系。另外，誘導培養基還可用于研究誘導分化過程中的其他檢測，如mRNA檢測、lncRNA檢測、microRNA檢測、蛋白表達檢測、膠原含量檢測、免疫組化檢測等。

本產品僅適用于科學研究。

操作方法

實驗準備

u 試劑配制：

預混液：室溫融化添加物B和添加物C，將融化后加入A液，充分混勻，配制成軟骨分化培養基預混液。

注意：添加物解凍后旋渦混勻、1000 g短時離心以使溶液集中于管底。將管內溶液加入A液后，吸取A液洗滌溶液瓶兩次，將洗滌液加入A液中。預混液必須充分混勻，2-8 ℃保存。

誘導完全培養基：取10 ml預混液置于15 ml離心管中，加入一支添加物D，充分混勻制成誘導完全培養基，此液現配現用。1 ml預混液需加入添加物D的量為10 μl。

注意：誘導完全培養基現配現用，2-8 ℃放置不得超過72小時。整個過程須確保無菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。

u 自備試劑：

l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）

l  磷酸鹽緩沖液（DPBS）

l  MSC完全培養基

l  4%中性多聚甲醛溶液

注意：若MSC完全培養基不含血清，則需要準備胰酶抑制劑。MSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴格控制消化時間。

操作步驟

1.      準備所需誘導分化的MSC，當細胞融合達85%左右時，用消化液消化細胞，細胞沉淀用成軟骨誘導預混液重懸。

2.      220 g離心5 分鐘，沉淀以預混液重懸，細胞密度約2×10⁶ cells/ml，再次離心，棄上清。

3.      沉淀以成軟骨誘導完全培養基重新懸浮，調整細胞密度為2×10⁶ cells/ml。

4.      分別取500 μl細胞懸液接種于15 ml離心管中，220 g離心5 分鐘。

注意：每管細胞的總數在5×10⁵至1×10⁶之間，一般以1個T25細胞培養瓶接種一個軟骨球為佳，細胞數過少形成的軟骨團塊較小，細胞數過多則可能會分開成塊。正常情況下可形成1-2 mm³的團塊。離心以細胞聚團為準，可適當調整。離心力過大，軟骨球不易懸浮，離心力過小則可能形成軟骨球效果不佳。

5.      旋松離心管蓋，將離心管輕輕豎直置于37 ℃、5% CO₂培養箱中靜置培養。

注意：24 小時內避免搖動細胞沉淀，以確保形成個團塊。離心管需使用聚丙烯材質無菌管。

6.      誘導培養24 小時后，輕輕撥動離心管底，使細胞沉淀團塊懸浮，重新放回培養箱繼續培養。

注意：細胞團塊重新懸浮的時間因細胞而定，基本在24-48 小時之間，以細胞團周圍有聚攏現象時為準。若細胞團塊貼壁較牢固，可用移液器輕輕吹動使其懸浮，注意不要吹散團塊。

7.      每2天更換新鮮完全誘導培養基。換液時輕輕吸去舊培養基，每管加新鮮配制的成軟骨分化完全培養基500 μl。

注意：換液時動作輕柔，以免吸出細胞團塊；誘導完全培養基必須經過復溫，否則影響誘導效果。在誘導培養2-3周后會出現大量細胞外基質，富含軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原。

8.      誘導培養14-20天，棄去培養上清，DPBS洗細胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室溫固定細胞1小時。

注意：培養結束時或中途可以選擇其他檢測方法，如基因表達檢測等，若采用自己擬定的檢測方法則后續方案需要自己擬定。一般軟骨球誘導致密后能進行染色處理，時間在14-20天左右，時間過久可能導致團塊內部出現空泡，甚至團塊裂開，具體時間請以自己細胞的特性自行確定。

9.      棄去固定液，DPBS洗2次，脫水、石蠟包埋后切片。

注意：脫水包埋可以用擦鏡紙包裹后使用自動脫水機脫水、包埋，也可以在原離心管中逐級更換脫水、透蠟的液體，手工包埋。過程中一定注意團塊不要丟失。

10.  阿利新藍染色：將切片進行脫臘和復水，阿利新藍染液染色30 分鐘，流水沖洗5 分鐘，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

注意：染色和制片過程中避免干片，干片后會導致組織形態發生變化，影響觀察、拍照效果。根據需要可以選擇蘇木素復染，不建議復染。

11.  結果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見藍色著色，該藍色染色的為酸性粘多糖，說明實驗所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無成軟骨能力。

注意：該鑒定方法和判定標準為定性實驗標準，可根據具體情況設置其他判定方法和標準。以上提供的是包埋切片染色的方案，若實驗室條件限制，可選擇直接對團塊進行染色，方法見B9、B10、B11。若試劑盒用于組織工程軟骨誘導，可作為除支架材料以外的誘導液使用。

B9.  棄去固定液，DPBS洗團塊2次。

注意：切片染色對實驗室條件和病理研究技術有一定的要求，但結果展示較為美觀，適合對美觀要求較高的使用。為降低試劑盒使用難度、降低時間成本，我們準備了結果判斷的備選方案，該方案操作相對簡單，對實驗室要求較低，耗時較少，也可適當縮短誘導周期。

B9.  阿利新藍染色：向團塊中加500 μl阿利新藍染液染色30 分鐘。棄染色液，加純水5 ml搖動清洗5分鐘/次，反復洗5次。

注意：染色液中的團塊不易看清，務必小心吸去上清，避免樣本丟失。樣本始終需要保持在液體中，避免失水導致形態改變。

注意：染色時間請根據實際情況確定，時間控制在10-30分鐘，時間太久顏色過深，可能不易分辨。

注意：使用直接進行誘導球進行染色時誘導周期可以適當縮短，一般情況下15天即可有藍色著色，時間越久藍色著色相對越深。具體誘導周期根據實驗室的具體情況進行調整。

B10.            結果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見深藍色著色，肉眼觀察也可見藍色著色，該藍色染色的為酸性粘多糖，說明實驗所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無成軟骨能力。

注意：結果拍照最好使用反射光拍照設備，用透射光的顯微鏡會導致結果呈深藍色或黑色�？梢允褂皿w式鏡、相機或手機相機進行拍攝，結果相對美觀。相機或手機相機拍攝時，將清洗過的藍色小球（誘導球）置于較為寬闊的培養皿，培養皿內裝足量的純水，保持水面平整，且沒過小球3-5毫米。皿下置放平整的白紙，避免使用鏡面做背景，可使用直尺置于下方進行大小的參照。盡量避免用強光照射，可以用散射光進行打光�？梢栽谛∏虻恼�上方拍攝，也可以稍微傾斜進行拍攝，避免液面反光。