Annexin V-GFP/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒

Annexin V-GFP/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒產品說明書

產品編號：

FY600016-20T

FY600016-100T

存儲條件：

2-8 ℃避光保存，有效期6個月；

-20 ℃避光保存，有效期12個月或更久；

避免反復凍融。

產品組分：

產品簡介：

Annexin V-GFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-GFP/PI Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒�？梢允褂昧魇郊毎麅x、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。

磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷酯酰絲氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應活性。

用帶熒光染料EGFP標記Annexin V，即Annexin V-GFP，便可用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單且直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。

本試劑盒還提供了碘化丙啶（PI）染色液，PI不能通過完整的細胞膜，可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經喪失，Annexin V-GFP可以進入到細胞漿內，與位于細胞膜內側的磷酯酰絲氨酸結合，從而也使壞死細胞呈現綠色熒光，PI雙染可以確定壞死細胞群。

 綜上所述，用Annexin V-GFP和PI染色后，正常的活細胞不被Annexin V-GFP和碘化丙啶染色；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-GFP染色，PI染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-GFP和PI染色。

自備耗材和設備：

1 ml 移液器

200 μl 移液器

20 μl 移液器

旋窩混勻儀

流式細胞儀

PBS

適用實驗與操作過程：

1.      調整細胞密度到大約1×10⁶ 細胞/ml。

2.      將0.2 ml 細胞懸液從細胞培養瓶中（2×10⁵ 細胞）轉移到干凈的離心管內。

3.      室溫1000 g 離心5 分鐘，去除培養基。

4.      細胞沉淀用0.2 ml 預冷的PBS 溶液輕輕重懸。

5.      室溫1000 g 離心5 分鐘，去除PBS。

6.      細胞沉淀用0.2 ml 預冷的結合緩沖液（組分C. Binding Buffer）輕輕重懸。

7.      加入5 μl Annexin V-GFP（組分A），5 μl PI染液（組分B），輕輕混勻。

8.      室溫（18-24°C）避光孵育10-15 分鐘。

9.      選作，用結合緩沖液或PBS補充體積至0.4 ml。

10.    將樣本放置在冰上避光保存，盡快檢測。

11.    用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測分析。

注意：每個檢測細胞數不超過1×10⁶個；盡快檢測，最易在半小時內完成檢測。

注意事項與常見問題：

 1. 是否需要防護？

PI具有毒性，操作時應注意防護，保護眼睛、避免吸入、并戴一次性手套。

2. 是否需要避光？

熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

3. 單個反應的細胞數量是否有要求？

推薦細胞數量10⁵ - 10⁶個之間。若細胞數量太低，流式細胞儀分析時會花費時間更長，同時得到數據在統計上可能會有偏差。

4. 細胞污染是否有影響？

如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。

5. 檢測時間要求？

染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。最好在半小時內完成檢測。

6. 胰酶消化是否有影響？

如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-GFP，最終導致染色失敗。

7. 細胞數要求？

推薦細胞數量為2×10⁵，實際操作中細胞數量可以再10⁵-10⁶之間，不推薦更高的細胞數量。一般6孔板中的一孔或者6 cm培養皿中，80%匯合度的細胞數量足夠一次檢測。

8. 使用時需及時清洗流式細胞儀。

PI流式上機時具有一定的粘性，請及時清洗流式細胞儀，避免堵塞。連續上機數量過多也可能導致儀器堵塞導致數據誤差，可在檢測到一定數量的樣本時進行次氯酸清洗，然后進行剩余樣本的檢測。