TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）

產品編號：

FY600017-20T

FY600017-50T

存儲條件：

-20 ℃避光保存，有效期12個月或更久；

若頻繁使用可在4℃避光保存3個月。

避免反復凍融。

產品組分：

產品簡介：

細胞在發生凋亡時，細胞內激活的DNA內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，DNA會被降解成為約180 bp-200 bp 的片段，而正�；蛟鲋臣毎�很少發生DNA斷裂。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT 酶）把FITC標記的dUTP標記到斷裂DNA片段的3’-OH 末端，從而使DNA片段標記上綠色熒光。然后進行熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測，這個方法被稱為TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法細胞凋亡檢測。

本產品能夠在DNA碎片末端標記上千bp的核苷酸，因而具有極高的靈敏性�？蓹z測的樣本類型有：石蠟包埋組織切片，冰凍切片，貼壁細胞和懸浮細胞。檢測方法可以使用熒光顯微鏡或者流式細胞儀。

自備耗材和設備：

1 ml 移液器

200 μl 移液器

20 μl 移液器

15 ml離心管

流式細胞儀

熒光顯微鏡

PBS

PI或DAPI染色液（選做）

蛋白酶K（選做）

適用實驗與操作過程：

1.        樣本處理：

1.1         懸浮細胞（細胞懸液）

a)      收集細胞，PBS洗滌一次。

b)      含1%甲醛的PBS或者4%多聚甲醛室溫固定30分鐘。搖床輕輕晃動防止細胞成團。

c)      PBS再洗滌1次。

d)      含0.2% Triton X-100的PBS重懸細胞，室溫孵育5分鐘。

1.2         貼壁細胞（細胞爬片/涂片）

a)      PBS洗滌細胞1次。

b)      含1%甲醛的PBS4%多聚甲醛室溫固定30分鐘。

c)      PBS洗滌1次。

d)      用含0.2% Triton X-100的PBS室溫孵育5分鐘。

1.3         冰凍切片

a)      4%多聚甲醛室溫固定60分鐘。

b)      PBS洗滌2次，每次5分鐘。

c)      含0.5% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘�；蛘哂�20 μg/ml的蛋白酶K室溫作用15-30分鐘（若用蛋白酶K通透處理，后續需用PBS洗滌2-3次，每次5分鐘，將蛋白酶K漂洗干凈）。

1.4         石蠟切片

a)      脫蠟：二甲苯脫蠟2-3次，每次5-10分鐘。

b)      復水：用無水乙醇，90%乙醇，70%乙醇，蒸餾水依次浸泡，每次2-5分鐘。

c)      滴加20 μg/ml 蛋白酶K室溫處理15-30分鐘。

d)      PBS洗滌2-3次，每次5分鐘，將蛋白酶K漂洗干凈。

2.        配制TUNEL反應體系：

3.        流式細胞儀檢測懸浮細胞或者細胞懸液：

a)      PBS洗滌細胞1-2次，每次5分鐘。細胞沉淀中加入TUNEL反應液50 μl。37℃避光反應60分鐘。

b)      PBS洗滌2-3次，每次5分鐘。

c)      選作：加PI或者DAPI染色液1 μl /ml，染細胞核。

d)      補加500 μl PBS，流式細胞儀檢測。

4.        熒光顯微鏡檢測細胞涂片或者細胞爬片或者組織切片：

a)      PBS洗滌1-2次，每次5分鐘。

b)      加入TUNEL反應液50 μl。37℃避光反應60分鐘。

c)      PBS洗滌3次，每次5分鐘。

d)      選作：加PI或者DAPI染色液1 μl /ml，染細胞核。

e)      熒光顯微鏡下觀測并拍照。

注意事項與常見問題：

 1. 單個反應的細胞數量是多少？

流式細胞儀檢測推薦細胞總數為3-5 × 10⁶。對于細胞爬片或者涂片，推薦60-90%匯合度。對于常規組織的冰凍切片或者石蠟切片，推薦切片厚度為2-5 μm，避免切片太厚。

2. 是否需要避光？

熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

3. 細胞離心條件？

對于懸浮細胞或者細胞懸液，洗滌時候離心條件推薦為300 g、5分鐘。

4. 細胞固定條件？

細胞樣品固定可以用1%甲醛的PBS溶液或者4%的中性多聚甲醛。組織切片樣品推薦用4%的多聚甲醛。

5. 細胞通透處理條件選擇？

細胞樣品通透推薦用0.2%的Triton X-100或者70%的預冷乙醇-20℃通透1-4小時。細胞樣品可以在70%的乙醇溶液中-20℃保存1周。冰凍切片樣品通透可以選擇0.5%的 Triton X-100或者20 μg/ml的蛋白酶K。石蠟切片樣本推薦用20 μg/ml的蛋白酶K進行通透處理。蛋白酶K做通透處理的時候，需要摸索通透時間，時間太短造成通透不徹底，時間太長容易脫片。。

6. 使用時需及時清洗流式細胞儀。

PI流式上機時具有一定的粘性，請及時清洗流式細胞儀，避免堵塞。連續上機數量過多也可能導致儀器堵塞導致數據誤差，可在檢測到一定數量的樣本時進行次氯酸清洗，然后進行剩余樣本的檢測。