肝類器官分化試劑盒

貨期兩周。

產品信息

產品名稱：肝類器官分化試劑盒

貨號：RC200128

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

組分1、2、3于-20至-80 ℃避光保存，組分4于2-8 ℃避光保存。組分1、2、3必須避免反復凍融；首次完全解凍后可以按使用量進行分裝，置于-20至-80 ℃長期保存；2-8 ℃條件下，穩定儲存2周。

適用范圍：

本試劑盒適用于定型內胚層細胞（SOX17⁺/FOXA2⁺細胞，詳見本公司定型內胚層高效分化試劑盒，RC200123）進一步定向肝細胞分化，同時進行立體培養，形成肝類器官。

產品介紹

類器官與懸浮培養是當前再生醫學研究與應用的前沿，是未來再生醫學與組織工程發展的趨勢。為適應日益發展的科研需求，并為生命科學尤其是再生醫學研究的需要，開發優化了相關產品，可以為科研工作者提供穩定的研究平臺，以助力研究的時效性和經濟性。該產品設計同時考慮再生醫學臨床前研究的需求，可以為研究人員提供大量穩定的種子細胞，加速應用后期技術的研發。

本產品無血清、成分明確、含有細胞保護因子，適合于人多能干細胞分化為定型內胚層細胞之后進一步肝類器官的誘導。

操作方法

實驗準備

u 完全培養基準備：

組分1-3（S1、S2、S3）均為完全培養基：2-8℃解凍。完全融化后輕輕搖勻，可以按照實際使用量分裝。分裝后立即存儲于-20至-80 ℃，避免反復凍融。

注意：2-8℃冰箱過夜，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請務必充分混勻，以保證培養基成分的均勻度。

u 自備試劑耗材：

l  多能干細胞完全培養基

l  定型內胚層高效分化試劑盒（RC200123）

l  低黏附培養板

l  細胞消化液（RegenTASE Ⅰ，RC200111）

l  細胞固定液（2-4%中性多聚甲醛溶液）

操作方法

1.        定型內胚層細胞消化：人多能干細胞提前分化為定型內胚層細胞，棄去培養基，用適量基礎培養基（RC200128-4），培養基加入量約2 ml/孔（六孔板），輕柔洗2次。棄去培養基，加入適量細胞消化液（RC200111），消化液加入量約1 ml/孔（六孔板），37℃細胞培養箱中孵育3-5分鐘。顯微鏡下觀察，待細胞邊緣發亮、回縮（細胞未漂起），小心吸棄消化液，加入適量基礎培養基輕柔吹打。收集細胞，200 g離心3-5分鐘。

注意：該試劑盒從定型內胚層細胞起始，定型內胚層細胞誘導方法見定型內胚層高效分化試劑盒，RC200123。

2.        S1階段-肝前體類器官誘導分化：S1完全培養基（RC200128-1）提前置于室溫復溫后放置到超凈工作臺備用。步驟1消化、離心收集的細胞小心棄去上清液，用適量S1完全培養基重懸細胞，接種于低黏附培養板，接種量約為5X10⁵細胞/孔，培養基量為3 ml/孔（六孔板）。懸浮培養，推薦每天半量換液。每次換液前輕柔旋轉培養板，做離心運動，使細胞匯聚于孔中間區域，換液時輕柔沿孔邊緣吸液。S1階段持續4-5天。

注意：以上操作方案以六孔板為例，若使用其他器皿可以根據需要自行調整方案。調整方案時建議以細胞密度為穩定因素。細胞培養箱條件為37℃、5% CO₂、飽和濕度。所有培養基在使用前必須進行室溫復溫。這些注意事項同樣適用于以下步驟。

3.        S2階段-胎肝類器官誘導分化：巴氏吸管吸取、收集S1階段培養物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量基礎培養基（RC200128-4）重懸培養物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量S2完全培養基（RC200128-2）繼續誘導分化。每天半量換液，方法及加入培養基量同前S1階段。S2階段持續6-8天。

注意：吸取培養物時務必要用巴氏吸管等口徑較大的移液材料，因培養物顆粒較大，不能使用1 ml等的移液槍頭，以避免對培養物造成損傷。培養物顆粒較大，離心時離心力必須小，離心沉淀松散，棄去上清時要足夠輕柔。培養物重新懸浮時也要盡量輕柔。

4.        S3階段-成熟肝類器官誘導分化：巴氏吸管吸取、收集S2階段培養物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量基礎培養基（RC200128-4）重懸培養物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量S3完全培養基（RC200128-3）繼續誘導分化。每天半量換液，方法及加入培養基量同前S1階段。S3階段持續8-10天。

注意：該部分注意事項同S2階段。該階段完成后的培養產物即為成熟肝類器官，可用于相關研究。S2、S3階段可收集部分培養物檢查肝系各標志物表達，樣品推薦冰凍切片行免疫熒光染色，樣品離心收集后，DPBS洗一次，用適量樣品固定液進行固定，安排后續包埋、切片及染色。

特別提示：以上所有操作均在無菌細胞培養室進行，細胞開放操作要在生物安全柜內進行；該研究常用的培養器皿包括培養皿、培養板，也可自行設計方案使用細胞培養瓶、細胞工廠等，請根據實驗需要自行選擇；細胞的初始狀態對分化的成功至關重要，請務必保證初始細胞的可靠性。該試劑盒僅用于定型內胚層細胞向肝臟類器官分化的研究，用于其他研究時該操作規程僅作為參考。

誘導過程示圖例及結果展示圖：

A：本試劑盒誘導肝類器官過程示意圖；B：各階段明場圖；C-E：肝系、上皮及功能性標志物檢測；F：HE染色觀察形態、結構；G：肝細胞低密度脂蛋白轉運功能測試。

產品引用：

閻貝貝. 尿素循環障得的臨床與遺傳學研究及PBMC來源hiPSC和肝類器官的建立[D].山東大學,2021.