人肺類器官分化試劑盒

產品信息

產品名稱：人肺類器官分化試劑盒

貨號：RC200130

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

組分1、2、3于-20至-80 ℃避光保存，組分4于2-8 ℃避光保存。組分1、2、3必須避免反復凍融；首次完全解凍后可以按使用量進行分裝，置于-20至-80 ℃長期保存；2-8 ℃條件下，穩定儲存2周。

適用范圍：

本試劑盒適用于人定型內胚層細胞（SOX17⁺/FOXA2⁺細胞，詳見本公司定型內胚層高效分化試劑盒，RC200123）進一步定向肺系細胞分化，同時進行立體培養，形成肺類器官。

產品介紹

類器官與懸浮培養是當前再生醫學研究與應用的前沿，是未來再生醫學與組織工程發展的趨勢。為適應日益發展的科研需求，并為生命科學尤其是再生醫學研究的需要，開發優化了相關產品，可以為科研工作者提供穩定的研究平臺，以助力研究的時效性和經濟性。該產品設計同時考慮再生醫學臨床前研究的需求，可以為研究人員提供大量穩定的種子細胞，加速應用后期技術的研發。

本產品無血清、成分明確、含有細胞保護因子，適合于人多能干細胞分化為定型內胚層細胞之后進一步肺類器官的誘導。

操作方法

實驗準備

u 完全培養基準備：

組分1-3（S1、S2、S3）均為完全培養基：2-8℃解凍。完全融化后輕輕搖勻，可以按照實際使用量分裝。分裝后立即存儲于-20至-80 ℃，避免反復凍融。

注意：2-8℃冰箱過夜，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請務必充分混勻，以保證培養基成分的均勻度。

u 自備試劑耗材：

l  多能干細胞完全培養基

l  定型內胚層高效分化試劑盒（RC200123）

l  基質膠

l  貼壁細胞培養板

l  細胞固定液（2-4%中性多聚甲醛）

操作方法

1.   S1階段：人多能干細胞提前分化為定型內胚層細胞 （建議分化效率大于80%，流式細胞術檢測SOX17⁺/FOXA2⁺細胞），棄去培養基，用適量基礎培養基（RC200130-4），培養基加入量約2 ml/孔（六孔板），輕柔洗2次。棄去培養基，輕柔加入S1完全培養基，培養基加入量約2 ml/孔（六孔板），每天換液，連續5天。

注意：該試劑盒從定型內胚層細胞起始，定型內胚層細胞誘導方法見定型內胚層高效分化試劑盒，RC200123。定型內胚層細胞狀態對肺類器官誘導成敗十分關鍵，需特別注意。

注意：以上操作方案以六孔板為例，若使用其他器皿可以根據需要自行調整方案。調整方案時建議以細胞密度為穩定因素。細胞培養箱條件為37℃、5% CO₂、飽和濕度。所有培養基在使用前必須進行室溫復溫。這些注意事項同樣適用于以下步驟。

2.       S2階段：S1階段5天誘導結束后，提前準備好立體培養用基質膠（推薦BD Biosciences公司，貨號356237，以下簡稱3D膠）。S1細胞用DMEM/F12培養基洗2次，加入適量的消化液（RegenTASE，RC200111或ACCUTASE；6孔板每孔700 μl左右，消化液覆蓋細胞即可），置于37℃培養箱中消化3-6 分鐘。每2分鐘置于倒置顯微鏡下觀察，待克隆邊緣發亮時即輕柔吸棄消化液。加入適量的S2完全培養基輕柔吹打細胞數次，將細胞懸液移至1.5 ml EP管中，200-300 g離心5分鐘。棄上清（20 μl槍頭進一步吸棄上清，過多上清殘留會影響立體培養），輕輕振蕩使細胞團塊散開，置于冰上2-3分鐘。取100 μl提前準備好的3D膠（冰上）加入細胞，輕柔吹打，使細胞分布均勻，切勿產生大量氣泡。按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推薦每孔滴6滴左右，置于37℃培養箱中20分鐘左右使3D膠固化，固化后加入3-5 ml的S2完全培養基，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養箱中培養。每2天換液一次，每4-6天傳代一次。S2階段共12天。

注意：試劑準備，BD Biosciences公司貨號356237的3D膠使用方法，須將3D膠置于冰上融化，分裝后保存于-80℃，避免反復凍融。使用時，提前按置于冰上過夜融化備用。

注意：為了降低消化過程對細胞狀態的影響，建議在消化液中加入10 μM的 Y-27632。

注意：移液槍吹打細胞時務必輕柔，切不可產生大量氣泡，本試劑盒全程均需注意此問題。

3D傳代方法：用無菌巴氏吸管將立體培養的類器官（含3D膠）刮下并轉移至1.5 ml EP管中，用1 ml槍頭機械吹散膠體， 200-300 g離心5分鐘。棄上清（20 μl小槍頭進一步吸棄上清，過多上清殘留會影響立體培養），置于冰上2-3分鐘。取100-200 μl左右提前準備好的3D膠（冰上）加入細胞，并輕柔吹打，使細胞分布均勻，按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推薦每孔滴6滴左右，置于37℃培養箱中20分鐘左右，使3D膠固化，固化后加入3-5 ml S2完全培養基，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養箱中培養。

注意： 傳代比例1：2到1：4，根據類器官生長情況具體判斷。

3.       S3階段：S2階段誘導12天后，3D培養物用基礎培養基輕柔洗2次，加入適量S3完全培養基，S3階段3D傳代同S2階段，S3階段共20天，形成立體的含肺譜系多種類型細胞的肺類器官。

特別提示：以上所有操作均在無菌細胞培養室進行，細胞開放操作要在生物安全柜內進行；該研究常用的培養器皿包括培養皿、培養板，也可自行設計方案使用細胞培養瓶、細胞工廠等，請根據實驗需要自行選擇；細胞的初始狀態對分化的成功至關重要，請務必保證初始細胞的可靠性。該試劑盒僅用于定型內胚層細胞向肺類器官分化的研究，用于其他研究時該操作規程僅作為參考。